Relatório Técnico - 2018 (Sinópse)

Relativamente ao solo do campo experimental da Ribamaior – Produção e Comércio de Frutas Lda, no solo do campo experimental da HBio Lda constatou-se a ocorrência de teores mais elevados de Ca (196%), K (30%), P (58%), Fe (66%), S (18%), Zn (84%) e Mn (106%), a par de teores de Mg sem diferenças significativas. Acresce ainda que o teor em matéria orgânica foi significativamente mais elevado no campo experimental da HBio Lda e que se detectaram teores relativamente elevados dos contaminantes Pb e As nos dois campos experimentais. A nível complementar aponte-se ainda que, embora as características físicas e químicas da água variem de forma heterogénia consoante o parâmetro considerado, os teores em Ca²⁺ da água no campo experimental da HBio Lda também são mais elevados (134%) e, em relação à drenagem superficial, apresenta maior área com propensão para a acumulação de águas (cerca de 80% da área total) o que se traduz numa menor necessidade de irrigação artificial dos terrenos (contrariamente ao terreno Ribamaior – Produção e Comércio de Fruta Lda, em que apenas 1/3 da sua área apresenta condições para a acumulação de águas superficiais). Assim, uma análise comparativa destes parâmetros, sem se equacionar qualquer tipo de adubação complementar, poderia apontar para uma maior capacidade de biofortificação em Ca do campo experimental da HBio (situação que, como adiante se verá não foi óbvia). Aponte-se ainda que a condutividade eléctrica do solo apresentou valores cerca de 60% mais elevados no campo experimental da empresa Ribamaior – Produção e Comércio de Frutas Lda, o que poderia apontar para um teor de sais mais elevado e, consequentemente, independentemente do grau de tolerância da espécie vegetal em causa, um maior dispêndio de energia para conseguir absorver água (efeito osmótico) prejudicando os seus processos metabólicos essenciais e, eventualmente, a biofortificação em Ca (situação que como antes se referiu, e adiante se verá, não foi  óbvia).

 Considerando a influência do clima no processo de biofortificação em Ca, nos dois campos experimentais subsistiram factores atípicos na região, não sendo de excluir algum efeito prejudicial no metabolismo de acumulação de Ca nos frutos. Aponte-se que durante a Primavera de 2018 a temperatura média do ar foi inferior ao normal, tendo-se constatado ainda que o mês de Julho foi o mais frio desde 2000 e Agosto o 2º mais quente dos últimos 88 anos (depois de 2003). Note-se, contudo, que tendo-se iniciado as pulverizações em meados de Maio, a quantidade de precipitação entre Março e Maio, foi de 429 mm (i.e., cerca de 200% do valor médio e foi a 3ª Primavera mais chuvosa desde 1931 (depois de 1936 e 1956).

No itinerário técnico de biofortificação em cálcio da pêra Rocha, inicialmente efectuaram-se 2 aplicações folheares distintas: uma com cloreto de cálcio e outra com nitrato de cálcio para limitar a potencial ocorrência de fitotoxicidade após o vingamento (i.e., fruto com ca. 30 mm). Verificou-se então que nesta fase, as acumulações dos diferentes elementos minerais não induziram toxicidade, quantificando-se algumas variações nos diferentes tratamentos que terão decorrido da elasticidade metabólica intra-específica, razão porque também não se visualizaram sintomas de toxicidade associados à morfologia externa dos frutos nesta fase do desenvolvimento. A subsequente aplicação única com cloreto de cálcio, e posteriormente de mais quatro aplicações também não revelou uma pronunciada acção potencialmente tóxica, muito embora se tenham verificado alguns efeitos na síntese de fotoassimilados. De facto, constatou-se que com a aplicação de ClCa₂ subsistiu um efeito negativo na P_n durante todo o ensaio, tendo os parâmetros de fluorescência da clorofila a evidenciado um moderado impacto no Y_(II) após a 4ª e 7ª aplicações e nas doses mais elevadas de ambos os produtos, e um impacto negativo no funcionamento do PSII (F_v’/F_m’) até à 4ª aplicação, independentemente do produto e dose aplicada.

Com a pulverização das folhas das árvores, teve início a mobilização de Ca na parte aérea das árvores, tendo subsistido alterações na cinética de translocação / mobilização de macro e microelementos minerais nos frutos, que apresentaram diferentes taxas de acumulação ao longo do desenvolvimento fenológico do fruto. Estas alterações, foram naturalmente condicionadas pelas interacções sinérgicas e antagónicas do metabolismo do Ca relativamente aos diferentes elementos minerais e ainda, adoptando uma análise comparativa entre os dois campos experimentais, eventualmente pelos factores edafoclimáticos prevalecentes a nível local.

Nos frutos, no decurso das pulverizações também não foram detectados sintomas acentuados de toxicidade, porém à colheita o índice de biofortificação em Ca embora percentualmente tenha sido menor no campo experimental Ribamaior – Produção e Comércio de Frutas Lda (por via analítica utilizando o XRF oscilou entre 24 - 59 % e com a absorção atómica oscilou entre 22 - 26%, enquanto que no campo experimental da HBio Lda oscilou entre 47 - 63 % e com a absorção atómica oscilou entre 3,5 – 14,3 %)) em termos absolutos foi substancialmente mais elevado (130% face ao campo experimental da HBio Lda).

Aponte-se que as diferentes concentrações obtidas para os diferentes elementos minerais quando se utilizam técnicas de fluorescência por raios-X ou espectrofotometria de absorção atómica, resultaram essencialmente de quatro factores: a) diferentes métodos de preparação das amostras (desidratação ou digestão ácida) para subsequente quantificação dos elementos; b) heterogeneidade no processo de enriquecimento das amostras em Ca (que irão determinar diferentes índices nas relações sinérgicas e antagónicas nos elementos minerais das amostras), pois durante o processo de pulverização, a quantidade de cloreto de cálcio total que incide em cada fruto poderá variar de forma substancial (o que determinará teores parcialmente diferenciados nas amostras do mesmo tratamento e que assim irão ser detectados durante o processo de quantificação); c) estando a absorção de cálcio condicionada pelos factores ambientais (vento, temperatura, radiação solar, humidade do ar, etc.), diferentes graus de exposição das amostras de cada tratamento a estes factores abióticos, pode favorecer a desidratação da calda de cloreto de cálcio pulverizada numas amostras em detrimento de outras (num mesmo tratamento), condicionando assim a absorção de cálcio; d) diferentes limites de detecção e quantificação em cada uma das técnicas utilizadas.

Considerando que a biofortificação em cálcio se traduz no desenvolvimento de um produto para consumo humano com características funcionais no plano fisiológico (nomeadamente prevenção face à osteoporose), constatou-se que, nos dois campos experimentais, a acumulação de Ca em frutos pós-colheita predomina largamente nas proximidades da epiderme (decorrente maioritariamente da pulverização) e ainda no coração do fruto (maioritariamente devido à captação de Ca proveniente da absorção radicular). Note-se que a acumulação de Ca no coração do fruto foi confirmada quando se utilizou o sistema µ-EDXRF M4 Tornado ™ mas não por microscopia electrónica de varrimento acoplada a sonda de raios-X. Porém, esta aparente discrepância decorre da dimensão / localização da amostra (embora no segundo caso possa ainda envolver pequenas variações nos teores de Mg, independentemente da elevada estabilidade deste último elemento mineral nas amostras). De facto, a utilização do sistema μ-EDXRF M4 Tornado ™, para além da heterogeneidade das áreas definidas entre os tratamentos, efectua determinações sobre áreas de maior dimensão nos frutos, aspecto que tenderá a minimizar as diferenças nos teores entre a zona próxima da epiderme e da região central do fruto (relativamente à utilização de microscopia electrónica de varrimento, com espectroscopia dispersiva de energias de raios-X - SEM-EDS). Relativamente aos restantes micro e macroelementos nutricionais subsistiram ainda variações apreciáveis na acumulação tecidular nos frutos.

Equacionando as características físicas e químicas dos frutos à colheita verificou-se que no campo da Ribamaior – Produção e Comércio de Frutas Lda a altura e o diâmetro foram mais acentuados (79,6-93,6 mm e 61,3-71,0 mm, respectivamente), face aos frutos da HBio Lda (72,2 – 84,4 mm e 61,4-70,0 mm, respectivamente), contudo nos dois campos não subsistiram variações significativas entre o controlo e os frutos biofortificados. Comparando as variações entre os frutos dos campos da HBio Lda e Ribamaior – Produção e Comércio de Frutas Lda, detectaram-se algumas diferenças que não foram apreciáveis na densidade (de 1029 – 1109 Kg m^-3 e 1019 – 1056 Kg m^-3, respectivamente) e no peso seco (13,18 – 14,59 % e 12,9 – 15 %, respectivamente). Note-se, contudo que, relativamente à densidade e peso seco, os frutos da HBio Lda não revelaram variações significativas entre o controlo e os tratamentos de biofortificação, porém os frutos do campo experimental da Ribamaior – Produção e Comércio de Frutas Lda embora tenham mantido uma tendência similar para a densidade, revelaram uma acentuada heterogeneidade entre os tratamentos. Em todos os tratamentos a dureza dos frutos foi inferior nos frutos provenientes do campo experimental Ribamaior – Produção e Comércio de Frutas Lda. Os açucares solúveis totais nos frutos dos dois campos experimentais apresentaram uma gama semelhante de valores e não parecem variar de modo significativo com a biofortificação em cálcio. Os teores máximos de ácido málico, destacaram-se igualmente no campo experimental da HBio Lda, sendo estes mais baixos no controlo. Por oposição, os níveis de ácido málico nos frutos do campo experimental da Ribamaior – Produção e Comércio de Frutas Lda apresentaram alguma variação.

Relativamente aos parâmetros colorimétricos das folhas, ao longo do desenvolvimento fenológico dos frutos, os parâmetros L, a* e b* revelaram uma acentuada heterogeneidade nos dois campos experimentais. Aponte-se, contudo, que eventualmente estas variações nas folhas poderão decorrer, não de factores de stress mineral envolvendo a aplicação folhear de Ca (muito embora, como atrás se referiu, se tenham detectado algumas alterações no metabolismo acoplado à síntese de fotoassimilados) mas da senescência natural das folhas ao longo do ciclo vegetativo / reprodutivo das árvores. Nos frutos não subsistiram variações nos parâmetros colorimétricos (L, a* e b* - escala CIELab) na polpa dos frutos controlos e biofortificados em Ca dos dois campos experimentais, constatando-se ainda em todos os tratamentos um pico de transmitância máxima nos 550 nm.

Equacionando o efeito térmico (i.e., cozedura) sobre a polpa dos frutos biofortificados, constatou-se que as alterações verificadas foram residuais, podendo assumir-se que a biofortificação em Ca não afecta as mesmas.

Relatório técnico - 2019 (Sinópse)

No ano de 2019, a apesar de se alterarem as árvores sujeitas a pulverizações, tendo em conta a sua proximidade com as anteriores não se justificou a necessidade de novas análises de solo. A nível complementar efetuou-se novamente a análise da água de rega de cada pomar.

As características físicas e químicas da água, em relação aos resultados de 2018, evidenciaram alguma evolução química, variaram de forma heterogénea consoante o parâmetro considerado, sendo que em 2019, os teores em Ca²⁺ da água no campo experimental da HBio Lda. face a 2018, passando o campo Ribamaior- Produção e Comércio de Frutas Lda. a apresentar o valor mais elevado. No campo de ensaio da HBIO Lda. o perigo de alcalinização do solo aumentou e, por conseguinte, os cuidados com a sua utilização em solos mal drenados e em plantas pouco tolerantes aos sais (de salientar que este não é o caso da pera Rocha), evidenciando uma tendência mais corrosiva que o campo Ribamaior - Produção e Comércio de Frutas Lda. A água de irrigação do pomar Ribamaior, manteve a classificação para uso agrícola em C3S1, sugerindo os restantes valores que estamos perante uma água pouco corrosiva, tal como tinha sido determinado em 2018.

Tendo em conta a influência do clima no processo de biofortificação em Ca (que teve início em finais de Abril, tendo decorrido até inícios de Agosto), nos dois campos experimentais, verificou-se que contrariamente ao ano passado, durante a Primavera de 2019 a temperatura média do ar foi superior ao normal. Constatou-se ainda que o mês de Maio foi o 3º mais seco desde 2000 (depois de 2006 e 2003). Por outro lado, o verão de 2019 foi classificado como frio e seco quando equacionando a temperatura do ar e a precipitação respectivamente, destacando-se Junho como o mais frio desde 2000 e um período de seca meteorológica em todo o território entre Junho e Agosto.

No decorrer do segundo ano de projecto, o itinerário técnico de biofortificação de pêra Rocha em cálcio, compreendeu duas fases. Inicialmente efectuaram-se 3 aplicações folheares com cloreto de cálcio (0 kg ha^-1 e 4 kg ha^-1) a fim de limitar a potencial ocorrência de fitotoxicidade após o vingamento (i.e., fruto com ca. 30 mm). No decorrer desta fase, não se visualizaram sintomas de toxicidade associados à morfologia externa dos frutos. Posteriormente, numa segunda fase após as três pulverizações iniciais, realizaram-se mais quatro pulverizações. Uma das linhas manteve a aplicação com 4 kg ha^-1 nas restantes quatro aplicações, enquanto na outra linha, as restantes quatro aplicações passaram a ser realizadas com cloreto de cálcio a 8 kg ha^-1 (dobro da concentração). Relativamente ao impacto deste itinerário no mecanismo fotossintético, os resultados mostram que mesmo na dose mais alta de CaCl₂ (8 % - 8 kg ha^-1) não há impactos (negativos) no desempenho da maquinaria fotossintética, considerando a totalidade dos parâmetros avaliados, em especial a taxa líquida de fotossíntese (P_n), que mostrou até uma subida marginal nas duas últimas avaliações, em linha com o papel que o cálcio tem na manutenção da eficiência da maquinaria fotossintética. Contudo, deve referir-se que no tratamento de 8 kg ha^-1 se observaram algumas folhas com as pontas queimadas / necrosadas em algumas das árvores analisadas. Assim, a utilização de qualquer destas doses poderá ser equacionada dependendo do compromisso entre o objectivo de maximizar a acumulação de Ca na pêra e eventuais impactos na produção.

De forma similar ao ano passado, a pulverização das folhas das árvores, deu início à mobilização de Ca na parte aérea das árvores, tendo ocorrido alterações na cinética de translocação / mobilização de macro e microelementos minerais nos frutos, constatando-se diferentes taxas de acumulação ao longo do desenvolvimento fenológico do fruto. Para ambos os campos, após a segunda pulverização os teores de Ca nos frutos sujeitos a pulverizações, eram ligeiramente superiores face ao controlo. Esta tendência manteve-se ao longo das pulverizações sendo que no caso do campo HBio Lda., se obtiveram valores significativamente superiores com o aumento da concentração nas quatro últimas pulverizações. Simultaneamente, no caso da HBio Lda, os teores de Ca nas folhas sujeitas a pulverização, foram no geral ligeiramente superiores ao controlo, enquanto que no caso da Ribamaior, os teores de Ca nas folhas foram ligeiramente inferiores nos tratamentos face ao controlo. Relativamente às interacções com outros minerais, apenas se salienta a relação de antagonismo com K.

Nos frutos, no decurso das pulverizações não se detectaram sintomas de toxicidade, obtendo-se à colheita um índice de biofortificação em Ca inferior em Ribamaior – Produção e Comércio de Frutas Lda. (por via analítica utilizando o XRF oscilou entre 9 – 36 % e com a absorção atómica oscilou entre 0 – 19 %) face a HBio Lda. (oscilou entre 8 - 44 % utilizando o XRF, e com a absorção atómica oscilou entre 0 – 71 %).

Equacionando as características físicas e químicas dos frutos à colheita em 2019, verificaram-se valores semelhantes de altura e diâmetro de frutos provenientes da Ribamaior – Produção e Comércio de Frutas Lda (81,6 – 87,5 mm e 63,3 - 65,0 mm, respectivamente), e HBio Lda (81,0 – 88,8 mm e 62,5 – 64,3 mm respectivamente). Não existindo variações significativas no diâmetro dos frutos de ambos os campos entre o controlo e os frutos biofortificados, constatamos que o processo de biofortificação não condiciona o calibre dos frutos obtidos. Comparando as variações entre os frutos dos campos da HBio Lda e Ribamaior – Produção e Comércio de Frutas Lda, detectaram-se novamente algumas diferenças que não foram apreciáveis na densidade (de 932 – 1024 Kg m^-3 e 946 – 1039 Kg m^-3, respectivamente), no peso fresco (152 – 176 g e 162 – 170 g, respectivamente) e no peso seco (13,2 – 14,3 % e 12,7 – 14,4 %, respectivamente). Note-se, contudo que, relativamente a estes três parâmetros, os frutos de ambos os campos não revelaram variações significativas entre o controlo e os tratamentos de biofortificação. No pomar HBio a dureza dos frutos foi mais alta que em Ribamaior, para todos os tratamentos. Com o tratamento CaCl₂ 4 % este parâmetro aumentou (20 %) em HBio, decrescendo (18 %) em Ribamaior, não se registando alterações subsequentes com o tratamento CaCl₂ 8 %. O teor de sólidos solúveis totais variou entre 9,5 e 11,1 °Brix nos dois campos, ocorrendo valores ligeiramente superiores no campo Ribamaior. A acidez dos frutos reduziu (18 %) com o tratamento CaCl₂ 4 % no pomar HBio, decrescendo também (14 %) com o tratamento CaCl₂ 8 % no pomar Ribamaior, podendo reflectir uma menor qualidade organoléptica dos frutos.

Relativamente aos parâmetros colorimétricos das folhas, ao longo do desenvolvimento fenológico dos frutos, os parâmetros L, a* e b* revelaram novamente alguma heterogeneidade nos dois campos experimentais, com os tratamentos a serem na sua maioria significativamente distintos do controlo nas fases finais do itinerário, podendo relacionar-se com as observações efectuadas durante as análises aos mecanismos fotossintéticos. Nos frutos, a análise colorimétrica da epiderme e polpa de frutos do campo Ribamaior, no decurso do seu desenvolvimento, não apresentou no geral, diferenças significativas entre o controlo e os restantes tratamentos, nos diferentes parâmetros (L, a* e b* - escala CIELab) analisados. No caso dos frutos do campo HBio, apenas se observaram diferenças no parâmetro L na epiderme, a a partir da 3ª recolha, com o controlo a apresentar valores ligeiramente inferiores face aos restantes tratamentos. À semelhança do ano anterior, constataram-se nos dois campos experimentais, em todos os tratamentos um pico de transmitância máxima nos 550 nm.

O teor de lípidos das amostras foi semelhante nos dois pomares, e não sofreu alterações com os tratamentos de CaCl₂. O perfil de ácidos gordos foi caracterizado pela maior abundância (67 %) de ác. linoleico (C18:2), seguido do ác. palmítico (C16:0) e do ác. linolénico (C18:3) (13 - 18 % e 5 - 9 %, respectivamente) e dos ácidos esteárico (C18:0) e oleico (C18:1) (4 - 5 %), além de ácidos gordos de cadeia inferior a C16 (1,7 %). Este perfil foi semelhante nos dois pomares, e não sofreu alterações com os tratamentos de CaCl₂. Também não se observaram diferenças nos valores de DBI entre tratamentos, o que reflecte estabilidade no grau de insaturação dos lípidos. A análise do MDA indicou que no campo da Ribamaior, observam-se diferenças significativas entre o controlo e o tratamento 4 %, porém observamos que o valor mais elevado se encontra de acordo com os valores obtidos para os diferentes tratamentos do campo HBio. Neste último, não se observam diferenças significativas entre o controlo e os restantes tratamentos.

Equacionando a firmeza e dureza da polpa (evidenciando valores inferiores face à firmeza), constatou-se que as amostras biofortificadas da HBio Lda. apresentaram valores superiores, com diferenças significativas, quando comparadas com a firmeza média das amostras controlo, enquanto que na Ribamaior - Produção e Comércio de Frutas Lda., não se observaram diferenças significativas. Relativamente à análise sensorial, no caso das amostras de pêra Rocha do pomar HBio, o painel de provadores identificou que as amostras biofortificadas de pêra foram significativamente diferentes das respectivas amostras controlo (sem tratamento), enquanto no pomar da Ribamaior, não foi possível distinguir as amostras de pêra Rocha biofortificadas com cálcio (8 %) das amostras sem tratamento.